第一步：準(zhǔn)備工作與環(huán)境消毒

　　在生物安全柜內(nèi)操作，提前開啟紫外燈照射30分鐘。實(shí)驗(yàn)人員需穿戴無菌手套、實(shí)驗(yàn)服與口罩。將水浴鍋預(yù)熱至37℃，CO2培養(yǎng)箱設(shè)定為37℃、5%CO2、飽和濕度。檢查試劑盒內(nèi)各組分是否齊全、未過期。

　　第二步：細(xì)胞復(fù)蘇與接種

　　從液氮罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中快速搖晃融化（1-2分鐘），避免冰晶緩慢解凍損傷細(xì)胞。用75%酒精消毒管壁，轉(zhuǎn)入生物安全柜。將細(xì)胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至含5-10mL預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先包被的T25或T75培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱。

　　第三步：培養(yǎng)基配制與更換

　　試劑盒通常提供基礎(chǔ)培養(yǎng)基與專用添加劑（如生長因子、血清、抗生素）。按說明書比例無菌混合，配制成培養(yǎng)基，4℃避光保存，建議2周內(nèi)用完。細(xì)胞貼壁后（約24小時(shí)），換液去除殘留DMSO；此后每2-3天更換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)與密度。

　　第四步：細(xì)胞傳代與擴(kuò)增

　　當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)基，用無菌PBS輕柔洗滌一次。加入適量胰酶-EDTA溶液，37℃孵育1-3分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、脫落。加入含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻，按1:2至1:4比例傳代至新培養(yǎng)瓶。

　　第五步：細(xì)胞凍存與長期保存

　　選取對數(shù)生長期細(xì)胞，按上述方法消化、離心。用細(xì)胞凍存液（含90%培養(yǎng)基+10%DMSO）重懸，按1mL/管分裝至凍存管。采用程序降溫盒（-1℃/min）或梯度降溫法，于-80℃過夜后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。

　　第六步：質(zhì)量監(jiān)控與污染防范

　　每日觀察細(xì)胞形態(tài)（應(yīng)呈長梭形、成纖維細(xì)胞典型特征）、生長狀態(tài)及有無微生物污染（渾濁、pH變化）。定期檢測細(xì)胞活力（臺(tái)盼藍(lán)染色）與支原體污染。